標記大腸桿菌

微生物細胞表面表達的蛋白質(zhì)可用于各種應(yīng)用并對其進行操作。它們已被證明在廣泛的領(lǐng)域非常有用，包括蛋白質(zhì)工程、抗體片段篩選、全細胞催化劑、生物修復(fù)吸附劑等 。然而，一個主要的限制是只有 20 種天然存在的氨基酸。如果可以擴展表達的氨基酸組或用合成衍生物專門替換某些氨基酸，則可以進一步操縱表面蛋白，潛在應(yīng)用的數(shù)量將呈指數(shù)增加。在這個方向上，一些研究小組已經(jīng)取得了顯著的成功。

利用 HDC 反應(yīng)的高可靠性，Link 和 Tirrell 將一種含疊氮化物的合成氨基酸摻入大腸桿菌的表面蛋白質(zhì)中 。他們選擇的氨基酸是疊氮高丙氨酸 (AHA)。之前已經(jīng)表明 AHA 可以替代蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸殘基  并且大腸桿菌的外膜蛋白 C (OmpC) 包含三個這樣的殘基。還創(chuàng)建了每個 OmpC 含有九個甲硫氨酸殘基的突變大腸桿菌用于比較。一旦 AHA 被納入 OmpC 中，使用生物素化炔試劑進行點擊反應(yīng)。兩種細胞都被成功地生物素化，但只有突變的大腸桿菌會與大分子抗生物素蛋白結(jié)合，這可能是由于額外的甲硫氨酸殘基周圍的空間擁擠較少。

標記 DNA

寡核苷酸代表了一類非常重要的生物分子。盡管過去由于缺乏知識，它們一直被制藥界“回避"，但它們最近發(fā)現(xiàn)了許多應(yīng)用，并被認為是許多研究領(lǐng)域最重要的工具。它們已被用于基因治療、作為治療白血病等疾病的反義劑、作為分子探針  等。添加不同的官能團進一步增加了它們的多功能性，特別是當人們認為可以引入功能化時在 3' 端、5' 端或內(nèi)部位置。新添加的官能團可以作為與各種生物分子進行生物偶聯(lián)的手柄。然而，目前用于 DNA 生物偶聯(lián)的方法效率低下。該程序必須能夠耐受水性條件，產(chǎn)生高產(chǎn)率，并且由此產(chǎn)生的連接必須在生物條件下穩(wěn)定。這是點擊化學的理想情況。

利用 HDC 反應(yīng)，Seo 等人。能夠?qū)晒鈭F標記到單鏈 DNA 的 5' 末端 。寡核苷酸經(jīng)過多次反應(yīng)修飾，在其 5' 端顯示末端炔烴，熒光團包含疊氮基官能團。獲得了 91% 的產(chǎn)物收率，但在反應(yīng)中沒有使用催化劑，導致 1,4-取代和 1,5-取代的 1,2,3-三唑產(chǎn)物的混合物。如果使用銅催化劑，則很可能僅產(chǎn)生 1,4-取代的三唑，并且反應(yīng)進行得更快。西拉等人。將 DNA 標記更進一步，合成了核苷，每個核苷的芳香核堿基上都含有一個末端炔烴。修飾的脫氧腺苷 (dA)、脫氧鳥苷 (dG)、脫氧胞苷 (dC) 和脫氧胸苷 (dT) 均包括在內(nèi)。使用固相合成，隨后合成了幾種寡核苷酸，其中含有一種修飾的核苷、兩種或根本不含（作為對照）。寡核苷酸及其雙鏈體的特性不受修飾的核苷的顯著影響，與對照相比時相似的解鏈溫度證明了這一點。然后通過點擊化學將含有疊氮基官能團的報告分子與修飾的堿基綴合。結(jié)合后，報告分子開始發(fā)出熒光，表明寡核苷酸已被成功標記。如果商業(yè)化，Seela 的修飾核苷可以使寡核苷酸標記變得微不足道。

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