多色流式細胞術和細胞分選是研究肝巨噬細胞（hepatic m?）的強大免疫學工具，但對于制備肝勻漿以進行這些分析的方法尚無共識。利用巨噬細胞和內(nèi)皮細胞報告小鼠的組合、流式細胞術和共聚焦成像，我們已經(jīng)表明，用于識別庫普弗細胞（Kupffer cells, KCs）的常規(guī)流式細胞策略會包括相當比例的CD31高表達肝竇內(nèi)皮細胞（LSECs）。無論為流式細胞術制備細胞的方法如何，這些內(nèi)皮細胞均存在，并且代表緊密附著在KC膜殘余上的內(nèi)皮。針對內(nèi)皮標志物（如CD31）的抗體對于排除這些細胞至關重要。這一結果將人們的注意力集中在最近發(fā)布的微陣列數(shù)據(jù)集中，這些數(shù)據(jù)集顯示與其他組織駐留巨噬細胞相比，KCs高表達與內(nèi)皮細胞相關的基因。我們的研究還揭示了常用分離方法中KCs在白細胞中顯著且特異性的丟失，這些方法導致增殖性和單核細胞來源的巨噬細胞被富集。因此，我們提出了一種方法，可以高產(chǎn)率地獲得肝髓系細胞，而不會產(chǎn)生細胞類型偏倚或被內(nèi)皮細胞污染。消除內(nèi)皮細胞污染及傳統(tǒng)肝庫普弗細胞分離和分析方法中固有的選擇偏倚的實驗方案。

愛丁堡大學Stephen Jenkins團隊用Cdh5-CreERT2 × mTmG報告小鼠。 他們發(fā)現(xiàn)：在肝組織流式分析中，肝臟KF細胞經(jīng)典的“F4/80高、CD11b低"設門群體中，有10%左右的細胞是CD31高表達的肝竇內(nèi)皮細胞（LSECs）。這些細胞看似巨噬細胞，卻在顯微鏡下露出真面目—— CD45?F4/80?CD31?的“雙陽"細胞，實為Kupffer細胞殘膜緊貼在內(nèi)皮表面形成的粘連體（doublets）！

肝臟灌注，酶消化裂解。常用的分離方法是Percoll密度梯度離心法。無論那種方法，包括300g雙離心法和50g慢速預離心法，都能在KCs群中看到“偽Kupffer細胞"——即CD31?污染。 而且，Percoll法雖然被廣泛使用，卻帶來了相對更嚴重的細胞丟失和比例偏倚。Percoll法獲得的Kupffer細胞數(shù)比300g法少7倍以上；Ki67陽性比例、骨髓嵌合結果均被高估。因此，建議排除CD31?污染。肝臟庫弗巨噬細胞流式檢測受到內(nèi)皮細胞干擾F4/80和CD31雙陽。